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双特异性抗体IgG亚型对T细胞重定向的影响
发布日期:2019-08-13 21:26   来源:未知   阅读: 次 

  2018六开彩开奖记录,双特异性抗体介导的T细胞重定向是癌症治疗的新希望。双特异性抗体结合两个靶点对于T细胞重定向是必要的,但是抗体亚型决定了双特异抗体的结构,同时也影响着T细胞重定向作用。本文以靶向CD19xCD3双特异性抗体为模型,研究了IgG1, IgG2, 和IgG4Fc突变体,以及两种嵌合亚型IgG1:2 and IgG4:2 ,即IgG1- 或者 IgG4-F(ab)2 移植在 IgG2的Fc上,构成的不同亚型双特异性抗体与FcR结合情况,含有一个IgG2 或 IgG4-F(ab)2 的结构被认为是最理想的结构,所有的结构形式都能以相同的水平结合其靶蛋白或者细胞。然而CD19xCD3 IgG2 不能同时结合两个靶点,未见T细胞向靶细胞聚集。嵌合亚型IgG4:2和IgG1:2完全恢复了IgG2 BsAbs的活性。这就证明F(ab)2 对双特异性抗体功能起主要作用。双特异性抗体的功能可以通过Fc,F(ab)2 的设计来调控。

  双特异性抗体介导的T细胞重定向杀伤肿瘤细胞被认为是最有希望的癌症治疗策略。第一个靶向CD3的双特异性抗体catumaxomab于2009年获得欧盟药品管理局批准上市,利用BITE技术获得的靶向CD19xCD3的双特异性抗体blinatumomab 于2015年获FDA批准上市。50KD的BITE 设计为一个多肽链上包含两个单链可变区片段scFV。目前,双特异性抗体的设计多种多样,从25KD的纳米抗体到≥150KD的IgG样融合蛋白。小分子量结构的好处是能让桥连细胞的距离更接近,以及更好的肿瘤组织渗透性。IgG样的设计有利于抗体的半衰期以及Fc引起的杀伤效应。

  T细胞杀伤作用需要免疫突触的形成。而这一过程高度依赖于TCR识别抗原递呈细胞表面MHC分子与所递呈的抗原肽形成的复合物。激活的免疫突触将释放细胞毒素和细胞因子起到杀伤作用。在免疫突触形成过程中,受T细胞与靶细胞之间距离的限制,像CD45这样的大分子被排除在膜间隙之外,这就要求细胞间的距离在15nm左右。IgG1 Fab两臂之间的跨度刚好接近这个距离。运用双特异性抗体重定向T细胞就要模拟免疫突触的形成。桥连T细胞TCR受体通过靶向CD3来实现,桥连靶细胞通过靶向靶细胞表面抗原来实现。多重因素将影响T细胞的重定向作用,比如靶向T细胞和靶向把细胞表面抗原分子的抗体亲和力不同,典型的例子如以“knob-in-hole”形成的CLL1xCD3 IgG1 双特异性抗体。靶向细胞抗原的表位距离也是重要的影响因素,比如以BiTE技术形成的双特异性抗体MCSPxCD3 和FcRH5xCD3 。在靶向5T4膜近端结构域的T细胞嵌合受体(CAR-T)的膜外端插入基于Fc的连接子增强了T细胞的活性和杀伤作用。与之相反的是靶向CD19的T细胞嵌合受体不含Fc介导的连接子,T细胞激活程度很高,但是不能有效杀伤靶细胞。因此,双特异性抗体的结构特点,例如易接近性,膜表面抗原表位之间的距离,双特异性抗体的柔韧性都将影响T细胞重定向的作用。

  双特异性抗体的亚型同样影响着其功能活性,因为不同的抗体亚型有着不同的可变区展示,铰链区序列,二硫键结构。IgG的铰链区连接着Fc和Fab结构域,在长度,序列,二硫键构造上不同亚型各具特色。IgG1有着较长的铰链区,含有两对二硫键。IgG2具有最短和最刚性的铰链区,这是由于在三种主要构型中存在四对二硫键。IgG4含有和IgG2同样长度的铰链区(12个氨基酸),但是含有较多的脯氨酸,类似于IgG1只有一对二硫键(如图1A)。电镜观察显示:铰链区对IgG柔韧性的影响为IgG1 IgG4 IgG2 ,IgG1柔韧性最为理想。小角度x射线扫描不同亚型IgG F(ab)2 构象显示,IgG1构象为封闭Y形合物,介于Y/T形,以及开放的T形混合物,IgG4仅为Y/T形,IgG2主要存在Y形。尽管IgG1,IgG2,IgG4作为主要的抗体药物亚型,但是不同亚型对T细胞重定向活性的影响鲜有报道。

  为了评估抗体亚型对T细胞重定向的影响,本文以靶向CD19xCD3双特异性抗体为例,固定Fab,对其Fc段以IgG1,IgG2,IgG4为基础进行交换。结合CD19膜远端结构域的亲本抗体来自于人源化抗体blinatumomab可变区,结合T细胞CD3ε亚基的亲本抗体序列来自于抗体OKT3。为了降低FcγR 的作用,构建了Fc突变体IgG1 FES, IgG2 σ1和IgG4 PAA 以减少FcγR 的结合。另外构建了两种嵌合亚型F(ab)2 和IgG1及IgG4的铰链区移植在IgG2 σ1-Fc 上,构成IgG1:2 σ1 和 IgG4:2σ1。分别通过SPR,流式细胞术在蛋白和细胞水平上对所产生不同亚型的抗体进行了鉴定。体外活性实验验证了双特异性桥连T细胞以及对靶细胞的增殖的抑制作用。本文以CD19xCD3双特异性抗体为模型,很好地展示了不同亚型结构双特异性抗体分子的柔韧性以及对T细胞活性的影响。

  回转半径(Rg)是衡量蛋白质致密性的指标,也是衡量蛋白质柔韧性的指标。通过小角度x射线扫描(SAxS)分析作为代表性分子的CD19亲本抗体,确定了每个IgG亚型的Rg,IgG2和IgG4比IgG1具有更刚性的Rg值。另外嵌合IgG与天然IgG具有相同的Rg值。

  T细胞重定向的活性受双特异性抗体对靶细胞亲和力的影响,通过SPR测定了CD19和CD3亲本抗体以及双特异性抗体的亲和力(如表3)。所有的抗体无论何种亚型对CD19和CD3δε-Fc 的亲和力基本一致,对CD19的亲和力在2.3–5.6 nM ,对CD3δε-Fc的亲和力在14.4–42.2 nM 。

  接下来,通过流式细胞术检测了双特异性抗体模型对靶细胞的结合(如表3),靶细胞分别用了CD19低表达细胞株HBL-1 和高表达细胞株Daudi ,靶细胞转导红色荧光蛋白用来表征T细胞杀伤作用。CD3亲本抗体不能结合CD19表达细胞,CD19亲本抗体不能结合人T细胞,证明亲本抗体具有很好的特异性,双特异性抗体对于靶细胞有和亲本相似的结合力,相对减弱了2-3x,而二价CD3 IgG2 σ1 相对于其它亚型的CD3抗体对T细胞的结和力下降了6-10x。另外单价的双特异性抗体对CD3的结合比亲本抗体的结合至少减弱了10x,RSVxCD3 双特异性抗体比起CD19xCD3 双特异性抗体都有稍微高出2-3x的结合力,无论是在具有相同臂的何种亚型下,都有同样的结果。CD19xCD3 IgG1 FES 是所有双特异性抗体亚型中结合力最强的,EC50为8nM,CD19xCD3 IgG2 σ1 比CD19xCD3 IgG1FES 结合力弱7x,EC50为55nM。其它亚型gG4PAA, IgG1:2 σ1, and IgG4:2 σ1 结合力介于中间,EC50约为30nM,比CD19xCD3 IgG1 FES 弱3x左右。

  效应细胞和靶细胞之间的联系是效应T细胞执行其效应所必需的。为了区分两种细胞,靶细胞被CellTrace Violet 标记,T细胞被CellTrace FarRed 标记。为例检测双特异性抗体的细胞聚集功能,靶细胞首先跟20 μg/mL 的双特异性抗体预孵育,然后与效应T细胞共孵育,抗体的浓度根据单价抗体结合CD19和CD3的饱和浓度而定。在该浓度下,双特异性抗体对CD19高低表达的两种靶细胞的结合不因亚型不同而不同。CD19xCD3 IgG2 σ1 比起其它亚型对T细胞的结合弱25%,细胞聚集通过流式检测vilot-red双阳来判定。这些双阳性细胞以体积增大和粒度复杂出现,从而证实了细胞集群性质。

  在以CD19-细胞HLY-1 为靶细胞时未见细胞聚集现象(如图3A),除了IgG2 σ1 亚型,其它亚型双特异性抗体在以HBL-1为靶细胞时,有细胞低聚集现象(如图3B),比起未用抗体处理细胞有2x的聚集现象。而以Daudi为靶细胞时,与对照相比,双特异性抗体介导约30x左右的细胞聚集(如图3C)。在以HBL-1为靶细胞时,代表了双特异性抗体引起细胞聚集效应的检测下限,CD19xCD3 IgG2 σ1 虽然含有和亲本抗体对于CD19和CD3有同样的亲和力的结合臂,但是未能引起靶细胞聚集。

  采用动态T细胞重定向实验研究不同IgG亚型CD19xCD3 BsAbs的T细胞重定向活性。在桥连了T细胞和靶细胞之后,T细胞被激活释放细胞毒性颗粒。因此动态检测对靶细胞的杀伤主要检测4-5天里对靶细胞增殖的抑制。对CD19xCD3 BsAbs的评价抓要看有效性(最大杀伤力)和潜能(半抑制浓度IC50)。任何亚型的双特异性抗体对CD19-的靶细胞HLY-1RFP 都没有杀伤效果。

  我们更喜欢这个动力学实验,因为它提供了一个更好的全面的分析BsAb对肿瘤生长抑制的能力,而不是一个试图分析一个设置的单一时间点。然而,我们用流式终点法分析了靶细胞的活性。CD19xCD3 BsAbs 在拥有IgG1或者 IgG4 F(ab)2 时对靶细胞HBL-1 有最好的抑制效果,CD19xCD3 IgG2σ1 的抑制潜能要弱10x。CD19xCD3 IgG1 以及嵌合抗体IgG1:2 σ1 对Daudi 有最好的抑制效果。而IgG2 σ1, IgG4 PAA 以及嵌合抗体IgG4:2 σ1 对于Daudi 的杀伤在测定的浓度范围之内没什么区别。CD19xCD3 IgG2 σ1 在激活T细胞潜能上效果最差(IC50很大),两种靶细胞结果一致。

  为了探究这种问题是否具有普遍性,我们构建了CD20xCD3 双特异性抗体,CD20抗体序列来自与rituximab 。分析方法跟CD19xCD3一样,IgG2 σ1 亚型的CD20xCD3 在HBL-1 RFP 和Daudi RFP 靶细胞上有最差的抑制潜能,这也就证明这种现象属于普遍规律。

  抗体亚型对双特异性抗体的T细胞重定向作用还鲜有报道。虽然不同IgG亚型T细胞重定向BsAbs已有报道,但是还没有关于杀伤活性的并排比较的报道。在本研究中,我们评估了不同IgG亚型固有的不同结构特征对T细胞重定向活性的影响。本研究成功构建了Fc突变的IgG1 FES, IgG2σ1 和 IgG4 PAA 以及嵌合 IgG1:2σ1 和 IgG4:2 σ1. 的CD19xCD3 多种双特异性抗体。

  通过小角度x射线扫描(SAxS)分析作为代表性分子的CD19亲本抗体,确定了每个IgG亚型的Rg,我们进一步证明了嵌合子类IgG1:2σ1和IgG4:2σ1与IgG1,IgG4有同样的R g。小角度x射线扫描不同亚型IgG F(ab)2 构象显示,IgG1构象为封闭Y形合物,介于Y/T形,以及开放的T形混合物,IgG4仅为Y/T形,IgG2主要存在Y形。

  所有分子含有针对FcγR 结合力的突变,(T250, M252,S254, T256, M428) 降低了抗体对FcRn 的结合。沉默突变未改变抗体跟FcRn 的结合。IgG2 σ1 Fc 跟FcγR 有最弱的结合,这一特性也反映在了抗体的ADCC和CDC效应上。这一实验证实T细胞的功能也需要Fc来介导。

  CD19 和CD3 单臂亲和力比起亲本相应下降了3x,这也证明在体外无论是抗体亚型还是分子形式都影响着抗体的结合力。双特异性抗体在靶向CD19,CD3时,与亲本二价抗体相比,都有所下降。这可能是由抗原本身决定的,特别是特定的表位,在CD3的情况下,这些表位要么允许二价结合,要么不允许CD19结合。IgG2 σ1 亚型是T细胞结合最弱的。这表明,更多的刚性铰链区和高结构密实度的IgG2σ1亚型可能让结合CD3的结合力受损。比较不同的IgG亚类,RSVxCD3 BsAbs 比CD19xCD3 BsAbs 对T细胞的结合要强。这也意味之不同的抗体组合也影响着双特异性抗体与T细胞的结合,以往的研究报道有抗体和CD3ε结合构象改变的报道。因此不同亚型的抗体构象影响了其结合CD3的能力。

  双特异性抗体与双价抗体比较针对抗原结合力减弱并不新鲜,总之,我们证明了CD19xCD3 IgG2σ1与IgG1-或IgG4相比,不太适合与BsAbs 的T细胞重定向。IgG2目前被用于降低治疗性抗体的效应器功能,以中和可溶性配体或抑制受体与配体的相互作用,例如在EGFR 抗体上的应用。此外,IgG2亚型CD40抗体CDx-1140具有较好的Fc独立的激动剂活性。在本研究中,IgG2细胞的聚集能力明显较差,这可能是由于其柔韧性较低所致。通过嵌合抗体实验表明,我们可以很容易的结合工程分子与效应元件。通过将F(ab)2 带有IgG1或IgG4铰链区序列移植到IgG2 σ1 Fc 构成更为有效地分子。对于如何选择Fc功能要根据具体的需求而定。

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